Analisis CONTIG Sekuen Hasil Sequencing

Hasil sequencing dalam bentuk file ekstensi .ab1 

Jika anda melakukan sequencing, maka hasil sequencing yang akan anda jumpai yaitu dalam bentuk file berekstensi .ab1 berupa kromatogram dengan peak yang berwarna-warni untuk membedakan jenis nukleotida yang diwakilinya. Nukleotida A (Adenin) berwarna hijau, nukleotida G (Guanin) berwarna hitam, nukleotida C (Sitosin) berwarna biru dan nukleotida T (Timin) berwarna merah dan dapat dibuka dengan menggunakan program offline Bioedit seperti pada gambar  dibawah ini.

Fig. 1. contoh hasil sequencing yang baik

Sumber: www.nucleics.com

Fig. 2. contoh hasil sequencing yang kurang baik

Peak yang tinggi menunjukkan nilai kepercayaan yang tinggi pula. Jadi semakin tinggi peak trace maka makin dapat dipercaya jenis nukleotida yang ditunjukkannya (Fig. 1). Peak yang lemah, rendah dan saling bertumpuk menandakan kurang baiknya hasil analisis sekuensing DNA (Fig. 2). Hal yang menyebabkannya antara lain : masalah pada DNA template (tidak ada atau jumlahnya yang tidak mencukupi) dan masalah pada primer (jumlahnya tidak mencukupi dan primer tidak berinteraksi dengan template secara efisien)

Pemerikasaan hasil sequencing sebaiknya dilakukan dengan melihat seluruh grafik hingga selesai dan selanjutnya hasil sequencing disimoan dalam bentuk FASTA.

Analisis contig digunakan untuk membuang daerah yang bukan merupakan hasil konsensus dari kedua sekuen anda. Sehingga analsisi contig dapat digunakan sebagai alternatif dalam memerbaiki hasil sequencing yang kurang baik.

CONTIG

Contig (berasal dari kata contiguous) dapat didefinisikan sebagai rekonstruksi dari serangkaian bagian DNA yang saling tumpang tindih. Program komputer dapat digunakan untuk merakit kembali serangkaian bagian DNA tersebut ke dalam satu bentuk tunggal tanpa celah. Keterbatasan kemampuan mesin sequencing menyebabkan tidak semua bagian

DNA dapat diketahui urutan basanya (maksimal 1000 bp). Untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan sequencing dua arah dengan menggunakan primer dari vektor maupun primer spesifik. Sequencing dua arah dapat meminimalisasi kemungkinan kesalahan dalam proses sekuensing. Kedua hasil sequencing tersebut selanjutnya dapat digabungkan untuk mendapatkan sebuah gen utuh.

Prosedur untuk melakukan analsis contig dengan program offline bioedit sebagai berikut:

# Buka “New Alignment"
Klik File -> Import -> Sequence alignment file

^import 2 file sekuen yang akan di contig

Pilih kedua file yang akan dianalisis contig (tekan dan tahan tombol Ctrl). Selanjutnya Anda akan mendapatkan hasil seperti gambar di bawah ini:

Pilih salah satu sekuen dengan mengklik nama sekuen tersebut, seperti gambar dibawah ini:

# "Reverse Complement" sekuen anda

 Klik Sequence -> Nucleic Acid -> Reverse Complement

# Next “Pairwise Alignment” sekuen anda

Klik Sequence -> Pairwise alignment -> Align two sequence (allow ends to slide)

Setelah dilakukan pairwaise alignment maka anda akan mendapatkan hasil seperti dibawah ini:

hasil pairwaise alignment yaitu daerah saling tumpang tindih dari kedua sekuen yang menunjukan apakah kedua sekuen tersebut dapat di contig atau tidak.

Klik kedua nama pada sekuan tersebut sebelum langkah pairwaise alignment dilakukan.

# "Consensus Sequence" kedua sekuan dengan contig

Klik Alignment -> Create consensus sequence 

hasil konsensus kedua sekuen dari hasil sekuensing dua arah yang berbeda dapat dilihat pada gambar dibawah ini:

 # Simpan hasil konsensus dalam bentuk FASTA
Klik Edit -> Copy Sequences to Clipboard (fasta format)
Paste sekuen konsensus dengan menambahkan tanda “lebih besar dari” ( > ) dan diikuti nama sekuen dan sekuen DNA pada baris kedua seperti dalam gambar di bawah ini:
^Simpan file dengan extensi txt.

 #File FASTA  digunakan untuk analisis selanjutnya.