SELEKSI BIRU PUTIH

Seleksi biru putih (blue-white screening) yaitu metode untuk memisahkan sel yang mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert. Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau keberadaan DNA sisipan. Metode ini menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropyl Thiogalactoside atau isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside). Transforman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih, adanya warna biru karena senyawa X-gal dalam medium. Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan. X-gal adalah molekul yang mirip galaktosa, sedangkan IPTG merupakan inducer enzim β-galaktosidase. Hasil ini sesuai dengan literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil. Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil ditandai dengan warna koloni berwarna biru, sehingga dapat dikatakan percobaan meligasikan dan transformasi fragmen DNA berhasil dilakukan karena terdapat koloni putih. Jika koloni berwarna biru artinya proses transformasi yang dilakukan tidak berhasil hal ini dapat terjadi karena ukuran insert terlalu kecil sehingga tidak mampu membuat gen lac-Z terinaktifasi atau posisi sisipan yang tidak tepat, dan insert  yang diklon bersifat meracuni bagi sel bakter.
 

Metode Seleksi Biru Putih

1. Pembuatan sel kompeten

Satu koloni bakteri Escherichia coli diambil dengan tusuk gigi steril dan dibiakkan dalam eppendorf yang berisi 500 μl TFB (Transformation Buffer). Resuspensi dilakukan terhadap tabung eppendorf (vortex). Selanjutnya, eppendorf diinkubasi di dalam es selama 5 menit dan disentrifuse pada 5000 rpm selama 5 menit. Endapan (pelet) hasil sentrifuse ditambahkan dengan 500 μl TFB dan diresuspensi atau divortex kembali. Setelah itu, ditambahkan 1/12 volume TFB dan DMSO ± 20,8 μl. Campuran diresuspensi dan kemudian diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Hasil pelet di ambil dan di tambahkan kembali 500  μl TFB dan diresuspensi. Ditambahkan 1/12 volume TFB dan DMSO sebanyak 41,76 μl, di campur dan diinkubasi selama 10 menit. Sel kompeten di jadikan sebagai kontrol kemudian di tambahkan media LA yang dicampur dengan ampisislin. Setelah proses tersebut maka dilakukan proses ligas.

2.    Transformasi bakteri

Transformasi adalah ekspresi materi genetik asing yang masuk melalui dinding sel. Proses transformasi dilakukan dengan mencampurkan sekitar 50 μl sel kompeten dan 10 μl hasil ligasi lalu diinkubasi selama 20 menit. Pada dasarnya dinding sel berfungsi melindungi sel dari masuknya benda-benda asing termasuk DNA, tapi dalam kondisi tertentu, dinding sel ini bisa memiliki semacam celah atau lubang yang bisa dimasuki DNA. Sebetulnya ada lebih dari 1% spesies bakteri mampu melakukan transformasi secara alami, dimana mereka memproduksi protein-protein tertentu yang dapat membawa DNA menyeberangi dinding sel. Agar gen yang berupa fragmen DNA (insert) ini dapat masuk, maka DNA tersebut harus dibuat menjadi DNA plasmid terlebih dahulu dengan menyisipkannya pada suatu DNA vektor. Di dalam laboratorium, kita dapat membuat suatu bakteri menjadi kompeten (istilah untuk bakteri yang siap bertransformasi), misalnya dengan mendinginkannya pada larutan yang mengandung kation divalen seperti Ca²⁺ untuk membuat dinding sel menjadi berpori dan dapat dilalui oleh DNA plasmid. Dengan melakukan teknik ‘heat-shock‘. Sebanyak 50 μl sel kompeten diambil dan ditambahkan dengan 10 μl hasil ligasi, lalu diinkubasi di dalam es selama 20 menit. Campuran tersebut kemudian segera dipanaskan (heat shock) pada suhu 42^oC selama 45 detik. Setelah perlakuan heat shock, campuran diinkubasi di dalam es selama 5 menit. Campuran ditambahkan dengan 100 μl YT dan diinkubasi kembali pada suhu 37^oC kemudian dimasukkan ke dalam shaker dengan kecepatan 250 rpm selama 20 menit. Tahap akhir adalah bakteri disebar di atas media padat. Komposisi media pertama (kontrol +) adalah LA (Luria Agar), media kedua (kontrol -) berisi LA dan ampisilin, media ketiga (kontrol transformasi) berisi Luria Agar, X-gal, dan IPTG.

Keberhasilan Proses Transformasi

 Setiap sel termasuk bakteri memiliki sistem pertahanan diri terhadap benda asing termasuk DNA. Jika sel bakteri menemukan adanya DNA asing, maka enzim restriksi sebagai penjaga benteng akan memotong-motong DNA tersebut hingga menjadi pendek dan tak berfungsi lagi. Agar DNA plasmid yang ditransformasi tidak dicincang oleh enzim restriksi, maka ia harus memiliki bagian yang dinamakan ori atau Origin Of Replication yang dikenali oleh bakteri yang bersangkutan. Ori ini berfungsi ‘mengelabui’ bakteri agar tidak menganggapnya sebagai DNA asing. Ori juga merupakan signal agar bakteri tersebut dapat melakukan replikasi alias penggandaan DNA plasmid secara independen seiring dengan replikasi DNA genomny.

Umumnya bakteri tidak dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik. Untuk itu pada DNA plasmid yang di transformasikan harus ada gen penyandi antibiotik resisten agar bakteri hostnya menjadi tahan hidup di media yang mengandung antibiotik. Bakteri yang tidak berhasil disusupi oleh plasmid akan mati dengan sendirinya. Proses transformasi dikatakan berhasil apabila rangkaian DNA yang diintroduksikan dapat disisipkan ke genom sel inang (bakteri), diekspresikan dan terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya.

Reaksi ligasi tidak akan 100% berhasil menyambungkan vektor dan insert. Bisa saja terjadi vektor berligasi sendiri (vector self-ligation) atau justru insert yang berligasi sendiri (insert self-ligation). Insert biasanya disisipkan di pertengahan gen lac-Z yang merupakan penyandi lacZ-å subunit dari enzim ß-galactosidase subunit lainnya. lacZ-w subunit dihasilkan oleh gen yang terdapat pada kromosom bakteri hostnya. Enzim ini dapat memecah substrat seperti X-gal (suatu galaktosa yang dimodifikasi) menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole yang selanjutnya dioksidasi menjadi 5,5′-dibromo-4,4′-dichloro-indigo yang berwarna biru. 

Jika gen Lac-Z  masih utuh, maka koloni bakteri akan berwarna biru akibat pengaruh zat warna indigo yang dihasilkan. Jika insert berhasil disisipkan (diligasikan) dengan vektor, otomatis gen lac-Z nya akan terdistrupsi alias rusak dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang berwarna biru, sehingga koloni bakteri akan berwarna putih. Jadi hanya koloni putih yang tumbuh pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal sajalah yang kemungkinan mengandung gen yang kita transformasikan (terjadi seleksi biru-putih).